Our Treatment 当院の最新治療

胚凍結に用いる新しい凍結・融解液

当院で開発した
新たな凍結・融解液をご紹介します！

今から20年以上前に当院で開発されたガラス化法による凍結・融解液は、北里コーポレーションにより製品化され今では全国の約500の不妊治療施設で、患者様の胚・卵子を凍結保存するために使用されております。

当院では更なる成績向上に向けて、様々な製品改良の研究を継続的に行っております。そしてこのたび、着床率や妊娠率を向上させる“脂肪酸添加融解液”の開発に成功し、リニューアル製品として新発売されましたのでご紹介します。

開発背景

凍結融解の課題と解決に向けて

胚の凍結・融解における最大の課題は、融解後の胚や卵子の発生成績が低下することです。要因としては、細胞内小器官や細胞骨格の機能低下、分布変化などさまざまな報告がされています。凍結方法や使用する溶液は日夜研究・開発が行われていますが、発生能を向上させる具体的な打開策はまだ見つかっていませんでした。
そこで我々は今までとは違う目線で融解後の発生率に影響する因子を探索しました。多くの基礎実験を繰り返す中で凍結融解処理により細胞内の代謝が変化していることを見出し、その情報をもとに新たな凍結融解液を開発することを試みました。

脂肪酸添加融解液の開発

ミトコンドリア内での脂肪酸の分解について

脂肪がエネルギーとして利用される場合、まずはいくつかの物質に分解されます。その一つが脂肪酸です。脂肪酸はミトコンドリア内でコエンザイムA（CoA）という補酵素と結合してアセチルCoAとなり、その後多くの酵素が関わる反応を経てエネルギーを生み出します。脂肪酸がアセチルCoAとなる反応をβ酸化といいます。私たちは、このβ酸化に着目し、胚凍結によって失われるエネルギーの回復を試みました。

マウス、ウシ胚での実験

最初に、脂肪酸の最適添加濃度と添加時期についてマウス卵子を用いて調べました。その結果、脂肪酸混合液を1%の濃度で融解液に添加することで、卵子の融解後の脂肪量が回復することが明らかとなりました（図2）。また、融解液への脂肪酸添加により受精後の胚盤胞発生率は有意に向上しました（脂肪酸無添加群50%、脂肪酸添加群60%）。
そして、脂肪酸の代謝に関わる遺伝子の発現量を解析した結果、脂肪酸添加群の胚では無添加群と比較して有意に発現量が向上したことより、脂肪酸を添加することにより細胞の脂質代謝が活性化していることが明らかとなりました。
さらに、脂肪酸添加により仔への発生成績が向上すること、ならびに脂肪酸添加は生まれた仔の健常性や繁殖能力に影響しないことを明らかにしました。

図2 相対的な平均蛍光レベル（画像解析ソフトで蛍光の強度を数値化）

ヒト胚はマウス胚よりも大きいですが、胚が大きくなると凍結融解は難しくなります。このことから大きい胚においても効果があるのかを検討する必要があるため、我々は胚の大きさがヒトに近いウシ胚を用いて実験を行いました。凍結融解したウシ4細胞期胚を培養した結果、胚盤胞への発生率は有意に向上しました（脂肪酸無添加群54%、脂肪酸添加群65%）。このことから、脂肪酸は大きい胚や受精後の胚の凍結融解にも有用であることがわかりました。

次に、この脂肪酸添加融解液がヒトの胚においても有効なのかを確かめる２つの実験を行いました。
実験は、ヒトの凍結分割期胚と凍結胚盤胞に分けて行い、いずれも研究への利用に同意が得られたものを用いました。

① 凍結分割期胚（受精後2日目の胚）を用いた実験
凍結分割期胚を脂肪酸添加融解液により融解し、その後胚盤胞まで培養しました。その結果、脂肪酸添加群では無添加群と比較して、良好胚盤胞の発生率が有意に高くなりました。

② 凍結胚盤胞を用いた実験
凍結胚盤胞を脂肪酸添加融解液により融解し、胚の着床能力を評価する実験を行いました。その結果、脂肪酸添加群の方が無添加群よりも着床能が高いことがわかりました。

ヒト胚の実験

凍結胚盤胞を脂肪酸添加融解液により融解した場合と、脂肪酸無添加融解液で融解した場合の細胞内の脂肪量を比べると、脂肪酸添加融解液で融解した場合の脂肪量が有意に高いことがわかりました（図３）。

図3 細胞内の脂肪量の変化

これらの胚の着床能を評価する実験（疑似着床実験）を行ったところ、脂肪酸添加融解液を用いた場合の方が、胚が培養ディッシュに接着した後に増殖する面積が大きく、着床能が高いことが示されました（図４）。

図4 疑似着床後の接着面積の変化

また、アポトーシス（細胞死）した細胞を検出する方法を用いて胚の退行部分を比較したところ、脂肪酸添加融解液を用いた場合に栄養外胚葉（胎盤になる部分）の外側部分のアポトーシスが有意に抑制されました（図５）。

図5 胚の退行部分の比較

このことから、脂肪酸添加融解液は凍結により失われる脂肪量を回復させることで胚の着床時にエネルギーが不足することを防ぎ、その後のアポトーシスを抑制することで胚の退行を改善する可能性があることがわかりました。

胚移植後のhCG値が20mIU/mL以上で着床、胎嚢が確認できれば妊娠、胎児の心拍が確認できれば妊娠継続としました。

以上のことから、脂肪酸が添加された新規融解液は、凍結した卵子や胚を用いる周期の治療成績向上の一助になることが期待できます。これらの成果は下記論文にて発表いたしました。

本研究に関する原著論文
Effects of fatty acid supplementation during vitrification and warming on the developmental competence of mouse, bovine and human oocytes and embryos.
Ohata K, Ezoe K, Miki T, Kouraba S, Fujiwara N, Yabuuchi A, Kobayashi T and Kato K.
Reproductive Biomedicine Online. 2021; 43: 14-25.

Fatty acid supplementation into warming solutions improves pregnancy outcomes after single vitrified-warmed cleavage stage embryo transfers.
Amagai A, Ezoe K, Miki T, Shimazaki K, Okimura T and Kato K.
Reproductive Medicine and Biology. 2023; 22: e12517.

Maternal and obstetric outcomes following the transfer of embryos warmed with fatty acid-supplemented solutions
Ezoe K, Onogi S, Sawado A, Amagai A and Kato K.
BMC Pregnancy Childbirth. 2024 May 4;24(1):343.

Fatty acid supplementation during warming improves pregnancy outcomes after frozen blastocyst transfers: a propensity score-matched study
Sawado A, Ezoe K, Miki T, Ohata K, Amagai A, Shimazaki K, Okimura T and Kato K.
Sci Rep. 2024 Apr 23;14(1):9343.